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抗體多樣性形成機制及重組抗體表達技術(shù)

發(fā)表時間:2023-04-21 訪問次數(shù):635

在應(yīng)對復(fù)雜的生存環(huán)境過程中,人體免疫系統(tǒng)為抵抗各種外來物質(zhì)(抗原,例如病原體、細菌等)入侵,會產(chǎn)生多樣化的蛋白分子抗體,特異性識別有選擇的消滅外來物質(zhì)。B細胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答中,抗體的產(chǎn)生通常由兩個步驟構(gòu)成。首先,抗原入侵后被B細胞特異性識別。其次,B細胞會大量增殖分化,一部分分化成成熟的漿細胞,并大量分泌特異性抗體與抗原結(jié)合,消滅抗原;一部分分化為記憶B細胞,保留抗體的特異性信息用于下一次快速生產(chǎn)抗體。在這里,抗體基因需經(jīng)歷一系列的程序性DNA斷裂、重排和突變等過程,從而編碼抗原特異性的抗體分子。抗體類型轉(zhuǎn)換是抗體多樣化的重要一環(huán)。

抗體的結(jié)構(gòu)及多樣化過程
典型的抗體分子由重鏈和輕鏈組成,形成的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域又可以分為可變區(qū)和恒定區(qū),分別負責(zé)抗原的結(jié)合和下游免疫反應(yīng)的激活。抗體多樣化是指在免疫系統(tǒng)中產(chǎn)生的抗體具有非常高的多樣性,可以針對一系列不同的生物體細胞和分子,包括病原體、致病菌、腫瘤細胞和激素等。

B細胞發(fā)育早期階段,編碼可變區(qū)的V元件、J元件,以及重鏈可變區(qū)特有的D元件,可以通過核酸內(nèi)切酶RAG起始的V(D)J重排進行組合和連接從而形成可變區(qū)基因外顯子,所分泌的低親和力IgM抗體構(gòu)成了初始的抗體庫。在外周淋巴組織結(jié)構(gòu)生發(fā)中心中,B細胞特異性DNA去氨酶AID能夠起始可變區(qū)高頻突變和重鏈恒定區(qū)抗體類型轉(zhuǎn)換,從而形成了表達高親和力不同抗體類型的抗體庫。

抗體多樣化是通過基因重組、突變、修飾和重新組合等過程來實現(xiàn)的,使得抗體可以適應(yīng)各種不同的生物體和分子,從而形成高度特異性和廣泛有效性的免疫響應(yīng)??贵w多樣性是維護免疫系統(tǒng)健康和抗病能力的核心基礎(chǔ),也是研究和發(fā)展新型生物技術(shù)和生物藥物的基礎(chǔ)。


抗體類型轉(zhuǎn)換的分子機制
抗體類型轉(zhuǎn)換是指由免疫系統(tǒng)中的B淋巴細胞分泌的一類抗體(IgM),在機體免疫應(yīng)答過程中逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪活惪贵w(IgG、IgAIgE)的過程??贵w類型轉(zhuǎn)換是抗體多樣化過程中的重要一步,其產(chǎn)生的不同類型抗體能夠激活不同的下游免疫反應(yīng)。

B細胞特異性DNA去氨酶AID起始了這一過程,產(chǎn)生的DNA斷裂則由細胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)進一步連接完成整個過程。遺傳學(xué)證據(jù)清晰地表明,抗體類型轉(zhuǎn)換由兩步組成:第一步,AID介導(dǎo)的雙鏈DNA斷裂的產(chǎn)生;第二步,雙鏈DNA斷裂激活DNA損傷應(yīng)答機制將兩個雙鏈DNA斷裂連接起來。
1. AID靶向基因組DNA底物引起雙鏈DNA斷裂的機制

AAID去氨基酶活性示意圖。AID作用于N4位點,能夠?qū)捂?font face="Calibri">DNA上的胞苷(C)殘基脫氨產(chǎn)生尿苷(U);B、C、D:基因組轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄泡、負超螺旋結(jié)構(gòu)以及R-環(huán)可以提供單鏈DNA招募AID;深色線條和淺色線條分別代表DNA雙鏈的模板鏈和非模板鏈,紅線代表RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。EAID相互作用因子RPA復(fù)合物和RNA外切體復(fù)合物能夠為AID提供單鏈DNA底物。F:對向轉(zhuǎn)錄招募AID到非免疫球蛋白基因靶點:藍線代表轉(zhuǎn)錄, 紅線代表反轉(zhuǎn)錄。

2.雙鏈DNA損傷修復(fù)與S區(qū)斷裂末端連接
抗體類型轉(zhuǎn)換中產(chǎn)生的S區(qū)的雙鏈DNA斷裂的修復(fù),并不依賴于AID去氨酶活性。AID起始形成S區(qū)的雙鏈DNA斷裂可以激活細胞內(nèi)通用的雙鏈DNA損傷應(yīng)答系統(tǒng),最終非同源DNA末端連接系統(tǒng)將兩個S區(qū)斷裂連接起來。

DNA末端修復(fù)連接途徑

A: ATM依賴的雙鏈DNA損傷應(yīng)答機制。MRN復(fù)合體可以識別DSB末端招募ATM并激活ATM激酶活性, 使多種下游蛋白包括H2AX、53BP1等發(fā)生磷酸化。磷酸化的H2AX即γ-H2AX可以進一步招募其他雙鏈DNA損傷應(yīng)答因子MDC1, RNF8能夠與磷酸化的MDC1相互作用, 并泛素化修飾組蛋白H1。RNF168可以識別組蛋白H1泛素化修飾, 并進一步泛素化修飾組蛋白H2A53BP1識別組蛋白H2A泛素化修飾而進一步招募至DNA損傷位點。ATM磷酸化的53BP1能夠招募Rif1進一步抑制由CtIP介導(dǎo)的雙鏈DNA末端的單鏈切除, 從而使DNA斷裂末端更容易被非同源DNA末端連接途徑修復(fù)并同時抑制同源重組的發(fā)生。B:c-NHEJ過程中,Ku結(jié)合至DSB末端, DNA-PKcs被進一步招募至DNADSB,XRCC4/Lig4復(fù)合物最終連接兩個末端。A-EJ途徑中, PARP1可能參與了對DSB的識別, Mrel 1CtIP可能介導(dǎo)末端連接, 最終由Lig1Lig3進行末端連接。

抗體多樣化機制的相關(guān)研究進展
抗體產(chǎn)生和多樣化過程的缺陷在臨床上表現(xiàn)為各種免疫缺陷疾病,而抗體多樣化的失控則可能造成B細胞淋巴瘤的產(chǎn)生。

抗體多樣化中,抗體基因在基因組水平面臨DNA修飾和損傷的發(fā)生。這種DNA水平的損傷雖然受到精細地調(diào)控,但往往也造成了基因組的不穩(wěn)定性導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。生發(fā)中心B細胞來源的B細胞淋巴瘤中,AID起始的DNA損傷產(chǎn)生的染色體易位、基因突變等是癌變的主要機制之一。研究AID靶向機制和抗體多樣化中DNA損傷修復(fù)機制,可以為生發(fā)中心來源的B細胞淋巴瘤,如濾泡型淋巴瘤、彌漫大B細胞淋巴瘤等,以及CLL的治療和診斷提供新的思路和技術(shù)手段。

目前我們對抗體多樣化機制的認識仍存在大量的空白,致力于抗體類型的研究從未停歇。通過基因工程對編碼抗體的基因按不同需要進行加工改造和重新裝配,轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細胞從而表達抗體,這種通過基因工程重組表達抗體的技術(shù),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于抗體藥物研究。

重組抗體表達技術(shù)
重組抗體表達這項技術(shù)的研發(fā)也是基于抗體研究領(lǐng)域的科學(xué)家對于抗體多樣性研究和理解的基礎(chǔ)上,用于在外源性系統(tǒng)中表達人工合成的單克隆抗體。而普健生物也經(jīng)過多年的抗體表達實踐和對哺乳系統(tǒng)表達的優(yōu)化,研發(fā)出一項高效表達重組抗體的專有技術(shù)——哺乳表達系統(tǒng)高產(chǎn)量pATX系列載體及馴化293系列和CHO系列細胞,能實現(xiàn)全長抗體以及多種形式的重組抗體片段的高效分泌表達;無需免疫和篩選,直接利用抗體基因序列即可實現(xiàn)重組抗體的高產(chǎn)和可重復(fù)生產(chǎn)。

表達優(yōu)勢

1. 抗體藥物研發(fā)專家和技術(shù)團隊,提供個性化抗體發(fā)現(xiàn)整體方案,重組抗體表達量高,采用高密度轉(zhuǎn)染,可實現(xiàn)瞬轉(zhuǎn)表達量幾百毫克每升,穩(wěn)轉(zhuǎn)可優(yōu)化到克級。

2. 抗體表達經(jīng)驗豐富,已成功表達過多種形式的全長抗體(Human IgG, mouse IgG, human Ig A, IgM, IgE, mouse IgM,rabbit IgG 等)和抗體片段(scFvFab,tandem-scfv,VHH,Fc融合蛋白,bi-specific antibody等)。

3. 一站式服務(wù):擁有多種服務(wù)平臺,在實現(xiàn)重組抗體設(shè)計表達和純化的同時,進行抗體質(zhì)控和活性驗證,并由經(jīng)驗豐富的專家根據(jù)客戶需求進行人源化設(shè)計驗證。

4. 自主知識產(chǎn)權(quán)的GS敲除系統(tǒng)細胞系,長期穩(wěn)定表達,抗體質(zhì)量更穩(wěn)定。

5.
周期短,可提供2~3周急速交付重組抗體表達服務(wù)。

重組抗體技術(shù)優(yōu)勢
重組抗體包括嵌合抗體、人源化抗體、小分子抗體、雙特異性抗體等。與傳統(tǒng)的單克隆抗體和多克隆抗體相比,重組抗體具有獨特的優(yōu)勢,現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用在科學(xué)研究、免疫診斷及治療性抗體領(lǐng)域。在被廣泛應(yīng)用的情況下,重組抗體表達技術(shù)水平也在日益提高,重組抗體除了以上優(yōu)勢之外還有以下一些優(yōu)點。

1)重組抗體具有序列已知、抗體基因可以長期保存、抗體性能穩(wěn)定、實驗重復(fù)性好等優(yōu)點,而單克隆細胞株可能存在抗體染色體丟失、細胞復(fù)蘇后停止生長或死亡等風(fēng)險。

2)可以進行基因工程改造:重組抗體可以進行重組改造,包括抗體片段表達,同型置換,嵌合抗體,抗體人源化等。

3
可以大量制備抗體:重組抗體可以快速實現(xiàn)抗體的大量制備,不需要使用動物,克服使用動物的倫理問題。